Exkurz k části 2/4                       Takové to domácí sekvenování

Toto je krátká odbočka z hlavního textu, na který se vrátíte TUDY.

Takové to domácí sekvenování

Sekvenování DNA bylo kdysi zdlouhavé, náročné a nákladné. A dnes už není. Dneska je to dokonce tak lehké, že si to můžete zkusit i doma. Jestli chcete, tak já Vás to naučím 😉

Budete k tomu potřebovat: středně velký hrnec, sporák, autobaterii, plech na pečení, gel na holení, chromatograf (a pár dalších serepetiček, které snadno seženete na internetu). Začněte tím, že vezmete úsek DNA, který chcete přečíst, hodíte ho do hrnce a zahřejte na cca 96° C. Při téhle teplotě totiž dochází k tzv. denaturaci, tedy k rozpadu vodíkových můstků, které drží onu slavnou dvoušroubovici pohromadě. Takže se "rozšroubuje" a vzniknou dvě samostatná vlákna. Na tu teplotu bacha, moc ji nepřežeňte, chceme DNA jenom rozdělit, a ne ji poškodit. Proč ji chceme rozdělit na dvě samostatná vlákna? Abychom ji mohli namnožit! Protože jedna samotná molekula DNA je nám celkem k ničemu.

Jestli jste si představovali, že sekvenování DNA probíhá tak, že ji dáme pod mikroskop a čteme jednotlivá písmenka, tak takhle se to opravdu nedělá. Ta molekula je na to totiž moc malá a ty báze nejsou dost dobře vidět. Ale máme na to trik - když si od nějaké části DNA uděláme miliardy kopií, tak se s ní dá najednou pracovat. Takže po zahřátí sporák opět ztlumíme (na nějakých 60° C), přisypeme do hrnce primery, nukleotidy a DNA polymerázu a necháme ji chvíli pracovat. DNA polymeráza je takový šikovný malý enzym, který se umí navázat (s pomocí těch primerů) na osamělé vlákno DNA a vytvořit mu dokonale komplementárního kamaráda. Takže ze dvou samostatných vláken máme najednou dvě identické kompletní molekuly DNA, čímž jsme úspěšně zdvojnásobili její původní množství.

DNA polymerázu není těžké sehnat, protože je doslova v každé živé buňce (která má DNA). Právě s její pomocí se totiž buňky dělí. Což je základ veškerého života. K dělení potřebujete zreplikovat svoji genetickou informaci, což buňky dělají dost podobně, jako jsme to teď udělali my. Jenom bacha, až budete sekvenovat, nepoužívejte lidskou polymerázu, protože té úplně nesvědčí takhle vysoké teploty. Většinou se používá polymeráza z různých bakteriálních potvor, které žijí v horkých pramenech, takže je trocha horka nerozhodí. Pokud se Vám pro ně nechce jezdit do Karlových Varů, dá se jejich polymeráza koupit běžně na netu, stejně jako ty primery a nukleotidy (pro úplnost: nukleotidy jsou takové základní kameny, ze kterých bude polymeráza DNA stavět a primery zase označují místo, kde má se stavěním začít).

V minulém kroku jsme si tedy z jedné dvoušroubovice DNA vytvořili dvoušroubovice dvě. Udělejte totéž znovu a budete mít čtyři, pak osm atd. Celý proces opakujte tak dlouho, až z jedné původní molekuly vytvoříte několik desítek miliard jejích kopií. To zní jako práce na dost dlouho, ale dá se to v pohodě sfouknout za tři až čtyři hoďky. Nezapomeňte, že při každém opakování se počet kopií zdvojnásobí, tedy roste exponenciálně a o zákeřnosti exponenciálního růstu už jsme si povídali v jiném článku.

Díky exponenciálnímu růstu Vám to zahřátí, zchlazení a přisypání stačí zopakovat cca jenom 35x, abyste měli 235 kopií původní DNA. A 235 kopií je fakt hoooodně kopií. To na sekvenování bohatě stačí i s rezervou.

To, co jste právě teď provedli (tedy zreplikování jednoho původního úseku DNA do mnoha miliard identických kopií) se odborně jmenuje polymerázová řetězová reakce, zkráceně v angličtině PCR (pí sí ár). Pokud Vám tahle zkratka připadá nějaká povědomá, tak to by sakra měla, protože o PCR testech už čtete posledních mnoho měsíců v každých novinách, které otevřete (a kolikrát je ani nemusíte otvírat). A vy jste si mysleli, že to je to nějaká děsná věda. Ale houby, je to strašně jednoduchý a pochopí to každej, to jenom vědci machrujou s cizíma slovama, abyste tomu jakože nerozuměli 😉

Vytvořením mnoha kopií to samozřejmě nekončí, pořád je potřeba DNA přečíst. Zapomněl jsem Vám říct, že až budete do hrnce sypat nukleotidy, nezapomeňte tam přidat některé obarvené. Jak obarvené? Jakože barvou? Jo, jakože barvou. Na netu koupíte dusíkaté báze, ke kterým je uměle přifařená molekula nějaké barvy.

Báze jsou čtyři (A, C, G a T) a každá je obarvená jinou barvičkou, abychom je od sebe rozeznali. Do hrnce nasypete jak nukleotidy obarvené, tak neobarvené. Ty obarvené mají ještě jednu zajímavou vlastnost - jsou "dideoxy" (na rozdíl od neobarvených, které jsou jenom "deoxy"), což způsobí, že když je polymeráza použije, nemůže už dál pokračovat v syntéze DNA a skončí přesně na tom místě, kde přidala obarvenou bázi. Výsledkem je, že ty miliardy kopií DNA, které jsme si vyrobili, budou mít různou délku - některé budou mít stovky bází, některé třeba jenom tři, podle toho, kdy polymeráza náhodně narazila na obarvený nukleotid. Každá kopie je tak vždycky zakončená barvičkou, přičemž kopie stejné délky končí stejnou barvou.

A jdeme do finiše, následuje už jenom gelová elektroforéza. Z plechu na pečení si vyrobíte malou závodní dráhu. Na každý konec plechu zapojíte kabel autobaterie, takže jeden konec bude plus a druhý mínus. U mínusového konce vysypete ty miliardy kopií DNA, které jsme si před chvílí vyrobili. Molekula DNA není elektricky neutrální, takže se bude snažit dostat k plusovému konci plechu. Plech si kvůli tomu předem naplníte nějakým médiem, nejlépe gelem, který jí umožní průchod a zároveň ji dostatečně zpomalí. Delší úseky DNA mají větší odpor, takže budou procházet gelem pomaleji (a naopak, kratší rychleji). To Vám umožní je roztřídit podle délky.

Na konec plechu umístíte chromatografický detektor. To je taková šikovná mašinka, která umí poznávat barvičky. Tedy umí něco, co jste uměli už ve třech letech, ale chromatograf to umí i ve velmi malých, mikroskopických měřítkách. Jednotlivé, různě dlouhé útržky DNA budou postupně procházet detektorem v závislosti na své délce. A detektor zaznamená, kterou barvou každý úsek končí. Na konci Vám vytiskne chromatogram - na první pozici červená, na druhé zelená, na třetí modrá, na čtvrté zase červená, na páté zase červená, na šesté zelená atd. Takhle si projdete několik miliard pozic a máte kompletní sekvenci DNA 😉 Pohoda.

Nedá se to bohužel dělat najednou, DNA si musíte nejdřív rozsekat na menší části a dělat to postupně. Ale i tak to není nic složitého. Tak a teď si už můžete po večerech taky číst něčí genom, je to sranda. Může se to hodit i v případě, kdy v ložnici svého muže najdete cizí ženský vlas a chcete se přesvědčit, že nepatří Vaší nejlepší kamarádce. Když je to taková lambáda, proč to těm vědcům v 90. letech trvalo tak dlouho? Například proto, že ty věci, které si dneska koupíte na netu, tehdy ještě na netu koupit nešly (protože tenkrát to bylo s internetem vůbec takové složitější, víme). A taky proto, že teprve právě během práce na Human Genome Project tihle chytří lidé vymysleli spoustu vychytávek, jak si tu práci usnadnit a urychlit. Takže na konci projektu už měli k dispozici mnohem pokročilejší technologie než na začátku.

PCR test na koronavirus je taky v podstatě sekvenování genetické informace. Tentokrát nečtete DNA, ale RNA (protože koronaviry stále jedou na téhle primitivnější platformě), což je ale v zásadě jedno (pomocí reverzní transkriptázy můžete například informaci z RNA snadno přepsat do DNA a pak pokračujete standardním postupem). Nejdřív si požadovaný úsek genetické informace, charakteristický pro tento koronavirus, namnožíte metodou PCR (stačí použít správné primery) a pak se podíváte, jestli váš vzorek (tedy ten konec špejle, který Vám strčí nechutně hluboko do nosu) obsahuje příslušnou sekvenci. Pokud ano, jste pozitivní, pokud ne, jste negativní.

Kromě PCR testů jste určitě slyšeli i o protilátkových testech, které fungují na docela jiném principu. PCR testy hledají v těle virus samotný, respektive nějakou část jeho genetické informace, která je pro daný virus typická. Protilátkové testy neumí odhalit virus, ale umí detekovat specifické protilátky, které si tělo při boji s daným virem vytváří. Protilátkové testy jsou proto o něco méně přesné a spolehlivé než testy PCR (například proto, že virus je v těle tak krátce, že ještě nestihl vyvolat imunitní odpověď, anebo proto, že tato imunitní odpověď byla příliš slabá).

Pro případ, že by se mezi mými čtenáři náhodně vyskytl nějaký dement (což nepředpokládám, protože dement by to nedočetl až sem), dodávám drobné upozornění - domácí PCR testy s hrncem, autobaterií a plechem na pečení jsou velmi nespolehlivé a to, že Vám takový test vyšel negativní, neznamená, že nemáte covid! Pokud máte příznaky choroby, nechte se otestovat profesionály, kteří na to mají lepší výbavičku a navždy zapomeňte na tento návod! Tento návod je určen pouze k tomu, aby si lidé, kteří nejsou dementi, mohli učinit velmi hrubou představu, co se při PCR testech zhruba dělá.

Tak a teď, když už umíte sekvenovat, se můžete zase TUDY vrátit na hlavní text ;-)